Keratin 80 Thúc Đẩy Di Cư Và Xâm Lấn Ung Thư Biểu Mô Đại Trực Tràng Bằng Cách Tương Tác Với Prkdc Thông Qua Kích Hoạt Con Đường Akt

trừu tượng

Giới thiệu

Mặc dù những tiến bộ nổi bật đã được thực hiện trong điều trị ung thư biểu mô đại trực tràng (CRC), nó vẫn là ung thư đường tiêu hóa phổ biến nhất trên toàn thế giới, với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao 1 . Khoảng 25% bệnh nhân mới được chẩn đoán mắc CRC bị di căn, trong khi đó ~ 50% bệnh nhân có khối u cục bộ cuối cùng sẽ phát triển di căn, với hầu hết các khối u này không thể phát hiện được. Các dấu ấn sinh học lâm sàng có sẵn có độ nhạy v 24; độ đặc hiệu không đạt yêu cầu để đánh giá tiên lượng CRC 3 . Xác định các gen và / hoặc dấu ấn sinh học cụ thể có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ là vô giá để chẩn đoán sớm và tiên lượng CRC.

Keratin là protein tế bào sợi trung gian của các tế bào biểu mô chịu trách nhiệm cho tính toàn vẹn cấu trúc của chúng 4 . Keratin có thể được chia thành hai loại: axit hoặc loại I và loại II cơ bản hoặc thần kinh. Keratin 80 (KRT80) thuộc loại II, cùng với Keratin 7 (KRT7), Keratin 8 (KRT8) và Keratin 78 (KRT78). Gen KRT80 nằm trên nhiễm sắc thể 12q13 và mã hóa protein 452-amino-acid với khối lượng phân tử tính toán là 50, 5 kDa 5, 6 . Keratin được thể hiện trong nhiều khối u bao gồm ung thư biểu mô, sarcomas và neoplasms trophoblastic 7 . Keratin là đặc hiệu mô và đ 32;ợc thể hiện theo cách phụ thuộc vào sự khác biệt. Chúng là các dấu hiệu điển hình cho các tế bào biểu mô 8 . Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng keratin được thể hiện rộng rãi trong nhiều tế bào biểu mô ác tính và đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh di chuyển và xâm lấn tế bào 9, 10 . Tuy nhiên, mối tương quan giữa biểu hiện KRT80 và ung thư chưa được báo cáo, chưa được đề cập trong CRC. Do đó, chúng tôi tập trung vào vai trò của KRT80 trong CRC.

Các kết quả

KRT80 được điều hòa trong mô CRC của người

Biểu hiện RNA loại II thuộc họ keratin đã được kiểm tra trong cơ sở dữ liệu TCGA và Oncomine. Chỉ KRT80 cho thấy những thay đổi đáng kể trong các mô CRC, so với niêm mạc lân cận bình thường (Hình 1d, h). KRT7, KRT8 và KRT78 không có thay đổi đáng kể (Hình 1aẩu c, eTHER g).

TC TCGA cho thấy biểu hiện của keratin 7 (KRT7), keratin 8 (KRT8), keratin 78 (KRT78) và keratin 80 (KRT80) trong niêm mạc bình thường và ung thư biểu mô tuyến (COAD). Biểu hiện KRT7 trong đại trực tràng (TCGA đại trực tràng). Biểu hiện KRT8 ở đại tràng (Alon Colon). Biểu hiện KRT78 trong dấu hai chấm (Skrzypczak Đại trực tràng 2). Biểu hiện KRT80 trong đại trực tràng (Skrzypczak Đại trực tràng 2)

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Tiếp theo, 40 mẫu CRC được ghép đôi được đánh giá biểu hiện KRT80 mRNA bằng phương pháp PCR thời gian thực định lượng (qRT-PCR). Biểu hiện tương đối (ΔCt) của KRT80 trong các mô ung thư là 10, 56 ± 1, 60 và 13, 07 ± 2, 29 ở các mô bình thường lân cận ( p < 0, 001). Tổng cộng có 33 mẫu khối u (82, 5%) cho thấy biểu hiện KRT80 cao hơn trong các mô CRC so với niêm mạc bình thường được ghép nối, với 28 mẫu khối u (70%) có ít nhất tăng gấp đôi (Hình 2a). Phân tích Western blot xác nhận rằng mức protein KRT80 đ ;ược điều chỉnh tăng đáng kể trong các mẫu mô CRC so với các mô bình thường phù hợp (Hình 2b). Những kết quả này đã chứng minh rằng biểu hiện KRT80 đã được tăng lên ở mức độ phiên mã và tịnh tiến trong các mô CRC.

biểu hiện mRNA KRT80 trong 40 mô khối u và ghép nối niêm mạc bình thường liền kề bằng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực định lượng (qRT-PCR). Thang đo logarit của 2 -ΔΔCt đã được sử dụng để đo sự thay đổi của nếp gấp. -actin làm tài liệu tham khảo nội bộ. Western blot đã được thực hiện để kiểm tra biểu hiện protein KRT80 trong tám mẫu mô ung thư đại trực tràng (CRC) ghép nối, với GAPDH là kiểm soát tải. N, mô bình thường; T, mô khối u. nhuộm hóa mô miễn dịch đại diện (IHC) c ủa KRT80 trong niêm mạc đại trực tràng bình thường và các mô ung thư. , Phân tích Kaplan Kiếm Meier cho thấy tỷ lệ sống không bệnh (DFS) và tỷ lệ sống sót chung (HĐH) của bệnh nhân CRC với biểu hiện KRT80

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Liên kết giữa biểu hiện KRT80 và các thông số lâm sàng cho CRC

Bảng kích thước đầy đủ

Bảng kích thước đầy đủ

Phân tích tỷ lệ sống và ý nghĩa tiên lượng của biểu hiện KRT80 ở CRC

Ngoài ra, mô hình mối nguy theo tỷ lệ Cox đã được sử dụng cho các phân tích đơn biến và đa biến của DFS và OS. Trong phân tích đơn biến, giai đoạn T, giai đoạn N, giai đoạn M, giai đoạn AJCC, phân biệt, xâm lấn tàu và biểu hiện KRT80 được liên kết với DFS và HĐH (Bảng 3). Để điều tra thêm về mối quan hệ giữa tiên lượng của bệnh nhân và các thông số riêng lẻ, phân tích đa biến được thực hiện cho tất cả các yếu tố quan trọng xuất phát từ phân tích đơn biến. Kết quả cho thấy giai đoạn M, giai đoạn AJCC và biểu hiện KRT80 là các yếu tố tiên lượng độc lập cho DFS và HĐH (Bảng 4).

Bảng kích thước đầy đủ

Bảng kích thước đầy đủ

Xây dựng các tế bào CRC ổn định với sự sụp đổ hoặc biểu hiện quá mức KRT80

Đầu tiên, chúng tôi đã kiểm tra mức độ biểu hiện của KRT80 trong các ô CRC khác nhau. Kết quả cho thấy KRT80 được thể hiện cao trong các tế bào SW620 và Caco-2 và thấp hơn trong các tế bào RKO, so với các tế bào khác (Hình 3a, d). Để đánh giá hiệu quả của các chuỗi shRNA khác nhau và tránh các hiệu ứng ngoài mục tiêu, chúng tôi đã tạo ra ba plasmid với các chuỗi shRNA khác nhau và chuyển chúng thành các tế bào SW620. Hiệu quả của các shRNA đã được xác nhận bằng qRT-PCR (Hình 4b). Sau đó, shRNA1 v&# 224; shRNA2 được chuyển riêng sang các tế bào Caco-2 và SW620. Plasmid KRT80 được truyền vào các tế bào RKO. Knockdown hoặc biểu hiện quá mức KRT80 đã được xác nhận bằng qRT-PCR và Western blot (Hình 3c, e).

, Biểu hiện của KRT80 mRNA và protein trong các tế bào CRC. , , KRT80 mRNA và biểu hiện protein trong các tế bào CRC với sự điều hòa hoặc biểu hiện quá mức KRT80. , Ảnh hưởng của KRT80 đến di cư hoặc xâm lược. (* P <0, 05, ** P <0, 01)

Hình ảnh kích thước đầy đủ

nhuộm màu miễn dịch huỳnh quang (IF) đã được sử dụng để kiểm tra biểu hiện của Vimentin và E-Cadherin. Thay đổi hình thái tế bào trong các tế bào CRC được truyền bằng KRT80 hoặc vector trống. Phân tích Western blot cho thấy thay đổi các dấu EMT trong các tế bào CRC. Western blot cho thấy sự biểu hiện của AKT trong các tế bào CRC

Hình ảnh kích thước đầy đủ

KRT80 thúc đẩy di chuyển và xâm chiếm tế bào CRC, thay đổi hình thái tế bào và đánh dấu EMT thông qua con đường AKT

Di chuyển tế bào và xâm lấn là cần thiết cho sự phát triển khối u và di căn 11 . Chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm transwell để đánh giá tác động của biểu hiện KRT80 đối với sự di chuyển và xâm chiếm tế bào. Knockdown của KRT80 đã ngăn chặn sự di chuyển và xâm chiếm của các tế bào CRC, trong khi sự biểu hiện quá mức của KRT80 đã thúc đẩy các hoạt động này (Hình 3f, g).

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng EMT là cần thiết cho sự di căn của ung thư ác tính 12, 13, 14 . Các tế bào biểu mô mất tính phân cực và có được khả năng di cư và xâm lấn 15 . Các vi ảnh cho thấy sự biểu hiện quá mức của KRT80 trong các tế bào CRC có thể thay đổi hình thái của chúng từ hình tròn sang hình đa giác, cùng với việc tạo ra EMT (Hình 4b). Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IF) cho thấy biểu hiện thấp hơn của Vimentin, một chất đánh dấu trung mô, sau khi ức chế KRT80, trong khi biểu hiện c 911;a E-Cadherin, một dấu hiệu biểu mô, đã tăng lên (Hình 4a). Ngoài ra, phân tích Western blot đã được thực hiện để xác định vai trò của KRT80 trong EMT trong các tế bào CRC. E-Cadherin đã được điều chỉnh lại sau khi KRT80 bị ức chế, trong khi các dấu hiệu trung mô bị điều hòa quá mức, bao gồm N-Cadherin, Vimentin và Snail (Hình 4c).

Con đường AKT có thể tham gia vào việc di chuyển và xâm chiếm CRC, vì vậy chúng tôi đã kiểm tra các thay đổi trong AKT 16 . Sự biểu hiện quá mức của KRT80 đã thúc đẩy biểu hiện của p-AKT (Ser 473), trong khi biểu hiện của tổng AKT và p-AKT (Thr 308) cho thấy không có thay đổi đáng kể (Hình 4d).

Ức chế AKT có thể ức chế biểu hiện EMT, di chuyển tế bào và xâm chiếm

Afuresertib được báo cáo là chất ức chế con đường AKT hiệu quả cao 17 . Để kiểm tra chức năng của AKT trong CRC, chúng tôi đã ức chế biểu hiện AKT với Afuresertib. Kết quả cho thấy việc ức chế AKT có thể ức chế sự biểu hiện của các dấu hiệu trung mô, cũng như sự di chuyển và xâm lấn của tế bào, trong khi biểu hiện của E-Cadherin đã được điều chỉnh (Hình 5).

phân tích Western blot cho thấy chất ức chế AKT Afuresertib đã ức chế sự kích hoạt con đường AKT gây ra bởi KRT80 và sự biến đổi của các dấu EMT trong các tế bào CRC. , Afuresertib ức chế di cư và xâm chiếm các tế bào CRC. nhuộm màu IF cho thấy biểu hiện của Vimentin và E-Cadherin sau khi sử dụng Afuresertib

Hình ảnh kích thước đầy đủ

KRT80 tương tác với PRKDC trong các tế bào CRC

PRKDC là thành viên của họ phosphatidylinositol-3-kinase 18 . Các báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng PRKDC rất quan trọng để kích hoạt AKT 19, 20 . Kết quả của LC-MS / MS cho thấy KRT80 có thể tương tác với PRKDC, do đó xét nghiệm Co-IP đã được thực hiện để kiểm tra dự đoán (Hình 6a). Tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng LSCM để đánh giá khả năng tập trung tiềm năng giữa KRT80 và PRKDC. Kết quả đã chứng minh rằng KRT80 và PRKDC được tập trung chủ yếu quanh màng nhân trong các tế bào CRC (Hình 6b). Những dữ liệu này tiết lộ rằng KRT80 có thể tương tác với PRKDC trong các tế bào CRC.

xét nghiệm Co-Immunoprecipitation (CO-IP) cho thấy KRT80 có thể tương tác với PRKDC trong các tế bào CRC. Kỹ thuật kính hiển vi đồng tiêu quét quét laser (LSCM) đã được sử dụng để hiển thị colocalization của KRT80 và PRKDC trong các tế bào CRC

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Việc ngăn chặn biểu hiện PRKDC có thể ức chế biểu hiện của AKT và EMT, di chuyển tế bào và xâm chiếm

NU7441 có thể ức chế biểu hiện của PRKDC 21 . Do đó, chúng tôi đã ức chế biểu hiện PRKDC với NU7441, dẫn đến sự ức chế biểu hiện của AKT và các dấu hiệu trung mô cũng như sự di chuyển và xâm chiếm tế bào CRC, trong khi biểu hiện của E-Cadherin đã được điều chỉnh (Hình 7). Do đó, KRT80 có thể tương tác với PRKDC, sau đó là kích hoạt đường dẫn AKT, ảnh hưởng đến việc di chuyển và xâm chiếm tế bào.

phân tích Western blot cho thấy chất ức chế PRKDC NU7441 đã ức chế sự biểu hiện của PRKDC, chất này tiếp tục ức chế sự kích hoạt của con đường AKT gây ra bởi các dấu KRT80 và EMT trong các tế bào CRC. , Việc ngăn chặn PRKDC với NU7441 đã ngăn chặn sự di chuyển và xâm chiếm các tế bào CRC. nhuộm màu IF cho thấy biểu hiện của Vimentin và E-Cadherin đã được thay đổi khi biểu hiện PRKDC bị ức chế NU7441

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng KRT80 đã được điều chỉnh đáng kể trong CRC và biểu hiện KRT80 tăng lên tương quan với các thông số lâm sàng CRC. Bệnh nhân nhuộm khối u dương tính KRT80 có DFS và HĐH ngắn hơn. Ngoài ra, các mô hình hồi quy Cox cho thấy KRT80 là một dấu hiệu tiên lượng độc lập cho CRC. Hơn nữa, KRT80 có thể thúc đẩy di chuyển và xâm chiếm tế bào. Ngoài ra, sự biểu hiện quá mức của KRT80 có thể thay đổi hình thái tế bào CRC, từ hình tròn sang hình đa giác. Hơn n̗ 9;a, sự biểu hiện của các dấu hiệu trung mô đã được điều chỉnh, trong khi các dấu hiệu biểu mô bị điều hòa vì mối quan hệ chặt chẽ giữa EMT và di căn của khối u ác tính 13 .

PRKDC tham gia vào bước thắt của con đường nối không tương đồng của quá trình sửa chữa đứt gãy sợi DNA kép. Nó cũng tham gia điều chế phiên mã, duy trì độ dài telomere, điều hòa apoptosis, điều hòa chức năng protein ty thể và phosphoryl hóa nhiều protein 32, 33, 34 . Ngoài ra, là một dấu ấn sinh học trong các khối u ác tính, PRKDC tham gia di căn khối u trong ung thư tuyến tiền liệt, ung thư biểu mô tế bào vảy thanh quản và các khối u ác tính khác 35, 36, 37 . PRKDC đóng nhiều chức năng trong các khối u và do đó chúng tôi đã sử dụng LC-MS / MS để kiểm tra chức năng của nó trong nghiên cứu này. Kết quả cho thấy PRKDC có thể tương tác với KRT80 và có thể ảnh hưởng đến AKT và chức năng tế bào.

Đây là báo cáo đầu tiên về chức năng của KRT80 trong các khối u ác tính. Biểu hiện KRT80 đã được điều chỉnh trong các mẫu CRC, tương quan đáng kể với tỷ lệ sống kém. Những kết quả này cho thấy KRT80 có thể là một dấu ấn sinh học mới trong chẩn đoán CRC và là mục tiêu điều trị cho CRC.

Vật liệu và phương pháp

Phân tích cơ sở dữ liệu

Với sự chấp thuận của dự án bởi tập đoàn, TCGA RNA-Seq đã được tải xuống từ trang web của TCGA (//cancergenome.nih.gov/). Oncomine (//oncomine.org/) đã được sử dụng để thu được biểu hiện RNA KRT80 ở CRC và niêm mạc bình thường.

Bệnh nhân và mẫu mô

Một trăm hai mươi mẫu mô CRC để xây dựng TMA và 40 mô CRC khác được lấy từ Khoa Phẫu thuật Tổng hợp, Bệnh viện Đa khoa Thượng Hải. Bệnh nhân đã được hóa trị liệu hoặc xạ trị được loại khỏi nghiên cứu này. DFS và OS được định nghĩa là khoảng thời gian giữa phẫu thuật ban đầu đến tái phát / di căn xác định trên lâm sàng hoặc tử vong. Phân đoạn khối u được dựa trên kết quả bệnh lý dựa trên các hướng dẫn của AJCC. Các chẩn đoán đã được xác nhận bởi ít nhất hai nhà nghiên cứu bệnh học lâm sàng. Văn bản đồng ý thông báo được lấy từ tất cả các bệnh nhân. Nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Đa khoa Thượng Hải.

QRT-PCR

Tổng số RNA được phân lập từ 40 cặp mô CRC và dòng tế bào, sau đó được sử dụng để tổng hợp cDNA (TaKaRa, Tokyo, Nhật Bản), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mức mRNA KRT80 được định lượng bằng cách sử dụng SYBR Green Master Mix Kit (Takara), qRT-PCR được thực hiện bằng Hệ thống PCR thời gian thực (Ứng dụng Biosystems, Foster City, CA, USA). Các điều kiện khuếch đại được sử dụng như sau: biến tính ban đầu trong 30 giây ở 95 ° C, 40 chu kỳ biến tính trong 5 giây ở 95 ° C, ủ trong 30 giây ở 60 ° C v 24; kéo dài trong 30 giây ở 72 ° C, với bước mở rộng cuối cùng trong 30 giây ở 72 ° C. RT-qPCR được thực hiện ba lần và thay đổi lần (2 -ΔΔCt ) của biểu thức KRT80 được tính cho mỗi nhóm. Các mồi được sử dụng cho PCR định lượng là:

KRT80 chuyển tiếp: 5′- GCTGCTCTTGCCATAATCAA-3

KRT80 ngược: 5′-AATGCTCCTGCCCAATCTC-3

act-actin chuyển tiếp: 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3

-actin ngược: 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3

Chiết xuất protein và blot tây

Tổng protein từ các mẫu mô và tế bào CRC được chiết xuất bằng cách sử dụng dung dịch đệm xét nghiệm ức chế miễn dịch phóng xạ (RIPA) (Công ty công nghệ sinh học Beyotime, Giang Tô, Trung Quốc). Western blot đã được thực hiện như mô tả trước đây 38 . Các kháng thể chính sau đây đã được sử dụng: anti-KRT80 (1: 1000, Proteintech Group, Inc., Rosemont, IL, USA), anti-N-Cadherin (1: 1000, Công nghệ tín hiệu tế bào, CST, Danvers, MA, USA), chống E-Cadherin (1: 1000, CST), chống Vimentin (1: 1000, CST), chống ốc sên (1: 1000, CST), chống AKT (1: 1000, CST), chống p -AKT (Thr 308) (1: 10 00, CST), chống p-AKT (Ser 473) (1: 1000, CST), chống PRKDC (1: 1000, CST), chống GAPDH (1: 1000, CST), chống Act-Actin (1: 1000, CST).

IHC

TMA bao gồm 120 mô CRC được xây dựng bởi công ty thương mại (Outdo Biotech Co. Thượng Hải, Trung Quốc). IHC nhuộm TMA và phương pháp tính toán được mô tả trước 39 .

Truyền plasmid

chuyển tiếp shRNA1: GCACTATCTCCAAGGTGACTGTGAA

đảo ngược shRNA1: TTCACAGTCACCTTGGAGATAGTGC

chuyển tiếp shRNA2: GGATGCAGAGTGTCTTCATCG

đảo ngược shRNA2: CGATGAAGACACTCTGCATCC

chuyển tiếp shRNA3: GCCATTGCCTGAAACTGGAGGAGAA

đảo ngược shRNA3: TTCTCCTCCAGTTTCAGGCAATGGC

KRT80 chuyển tiếp: ATGGCCTGCCGCTCCTGCGTGGTT

KRT80 ngược: TTACTCTGAGACCTCCGACTCCT

Các tế bào CRC bị nhiễm các đơn vị tải nạp 5 × 10 5 / ml các hạt lentivirus. Các dòng tế bào ổn định được thiết lập sau khi lựa chọn kháng sinh sử dụng 1 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Biểu hiện KRT80 đã được xác nhận trong các tế bào CRC bằng cách sử dụng qRT-PCR và phân tích blot Western.

Xét nghiệm di cư và xâm lược

Tổng cộng, 1 × 10 5 tế bào nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh bò bào (FBS) đã được gieo vào các buồng trên của transwell (Corning, NY, Hoa Kỳ) và phương tiện có 10% FBS đã được thêm vào khoang dưới. Buồng trên được phủ mà không có Matrigel (Lõi) cho xét nghiệm di cư hoặc với Matrigel cho xét nghiệm xâm lược. Sau khi ủ trong khoảng thời gian thích hợp, buồng được cố định bằng metanol và sau đó nhuộm màu bằng pha lê tím (Beyotime). Sử dụng kính hiển vi ánh sáng, ít nhất năm trường &# 273;ược chọn ngẫu nhiên được chụp ảnh theo đó số lượng được tính trung bình. Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần.

NẾU nhuộm

Các tế bào được gieo vào sáu đĩa giếng với lớp phủ 10 mm trong 24 giờ. Sau khi rửa bằng dung dịch muối phosphat, các tế bào được cố định trong 4% paraformaldehyd. Sau đó được ủ với kháng thể chính qua đêm ở 4 ° C. Sau khi ủ mẫu với kháng thể thứ cấp liên hợp fluorochrom và 4, 6-diamidino-2-phenylindole lucifugally. Hình ảnh thu được bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Xét nghiệm Co-IP

Các tế bào được ủ trong bộ đệm ly giải RIPA có hiệu lực yếu (Beyotime) trong 30 phút ở 4 ° C, sau đó ly tâm ở 12 000 g trong 30 phút. Các kháng thể chống PRKDC và KRT80 đã được thêm vào bằng hạt agarose protein A và G (Sigma) và được ủ ở 4 ° C trong 6 giờ. Sau khi rửa, các phức chất được đun sôi và chịu sự phân tích của phương Tây.

Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD cho các biến hoặc tần số và tỷ lệ phần trăm liên tục cho dữ liệu phân loại. Việc so sánh giữa hai nhóm được thực hiện bằng kiểm tra của sinh viên và so sánh ba nhóm được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều. Các thử nghiệm chính xác của χ 2 hoặc Fisher đã được sử dụng để xác định tầm quan trọng của sự khác biệt giữa KRT80 và các biến lâm sàng. Các phân tích của Kaplan Kiến Meier với kiểm tr a thứ hạng log đã được sử dụng để đánh giá DFS và HĐH. Mô hình nguy cơ theo tỷ lệ Cox đã được sử dụng để điều tra tỷ lệ nguy hiểm và khoảng tin cậy 95% cho DFS và HĐH. Tất cả các phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm SPSS 20.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Giá trị P <0, 05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

Lời cảm ơn

Công trình được hỗ trợ bởi Quỹ khoa học tự nhiên Trung Quốc (NSFC) -81773188, 81760557, 81703081 và Chương trình cho những tài năng xuất sắc thế kỷ mới ở trường đại học (NCET) -12-0381. Và chúng tôi muốn đánh giá cao sự giúp đỡ của phòng thí nghiệm của Giáo sư Fuyu Yang từ Viện Vật lý Sinh học và Giáo sư Yaping Tu từ Đại học Creighton ở Hoa Kỳ.